水牛繁殖新技术研究进展
                                                                  杨红远  洪琼花
                                         （云南省畜牧兽医科学研究所，云南  昆明  650224）
　　
　　水牛作为一种重要的家畜，过去主要用于役使，随着社会的发展水牛作为畜力的价值越来越低。但是，水牛在恶劣生活环境下的高产肉率、高瘦肉率、高产奶量下的高乳脂肪率，在高热环境下的良好生活力等特点引起了越来越多的关注。发挥水牛的这些优点，发展水牛产业对发展经济，特别是提高农村人口的生活水平具有重要作用。然而，水牛的繁殖方面却存在着大量的问题，与黄牛相比繁殖率更低，这主要是由于水牛性成熟晚，季节性发情和发情表现不明显，受精率低等。所以，研究水牛的繁殖技术、快速提高水牛群体的数量和质量成为目前国内外畜牧业的一个热点。
1 .胚胎移植
　　水牛的胚胎移植方法从黄牛的胚胎移植发展而来。胚胎移植在水牛繁殖上的应用潜力是巨大的，它可以短期内产生大量同质高产后代，因此，在种公牛的选择上可以用它们的同胞和半同胞成绩，而不是原来那样应用它们的女儿成绩来测定，这样就大大缩短了世代差。这些技术的应用可以有效地降低世代差，从6.28到3.25，加快了遗传改良的速度。
　　自1983年Drost进行的第一次水牛胚胎移植在美国成功产下犊牛至今，20多年的时间里，人们做了大量的实验，一直在想方设法提高胚胎移植的效率。2006年，Danilda在菲律宾将河流型水牛胚胎移植到沼泽型水牛受体中也已经产出了犊牛；2007年，广西水牛研究所梁贤威等将体外生产河流型水牛鲜胚移植到沼泽型及沼泽型与河流型的杂交一代两个受体群中并产犊。虽然至今在印度就有186头胚胎移植产出的水牛，但是，与移植的胚胎数量相比，却远远没有达到黄牛的水平。由于胚胎移植是一套技术的集成，它包括供受体选择、同期发情、超数排卵、人工授精、胚胎回收和胚胎移植，所以，任何一个步骤出现问题，都会影响到整套技术的效果。水牛的超排反应能力低是一个主要的因素，虽然意大利的Presicce的研究证明初情期前的水牛在超排作用下卵巢上比成年水牛有更多的卵泡发育，但到目前为止，水牛每次超排冲出的胚胎还是在2枚左右。1999年，Misra在印度应用Folltropin超排法，每次冲胚所取得的胚胎平均为2.8枚，胚胎移植后的受胎率仅在26.4％。另一个原因是水牛精液质量的变异非常大，这可能由于水牛本身遗传的问题，也可能由于其它的环境和季节因素，而且，水牛的精液在低温保存的过程当中其自身的抗氧化酶的活力低而更易于被氧化，所有这些都造成了水牛卵母细胞受精率低下。
　　在水牛的胚胎移植中，水牛和黄牛属间的胚胎移植也被探索，Drost等将13枚水牛胚胎移植到同期发情的荷斯坦奶牛体内，但移植后没有犊牛产出。
      2 .体外胚胎生产
      2.1 卵母细胞的来源
　　在水牛超数排卵难以取得突破性进展的情况下，体外生产水牛胚胎成为国内外研究的热点。体外胚胎生产涉及到卵母细胞采集、卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵的体外培养。为了扩大卵母细胞的来源，人们作了各种各样的努力。来源于屠宰场的卵巢提供了一个廉价并且数量多的来源，Boni等在进行地中海型水牛胚胎体外生产时从每个卵巢取得的可用卵母细胞在2.4～3.3枚。相比之下，活体采卵主要采用的OPU(ovum pick up)技术的优势就更加明显，除使用OPU技术可以重复从优良水牛卵巢上取得用于体外胚胎生产的卵母细胞的优点之外，OPU技术可以使每个供体每个月比超数排卵提供更多的可移植胚胎（2∶0.6）。从卵母细胞的发育潜力来看OPU技术更好。在印度， Manjunatha等应用OPU技术从供体水牛卵巢上采集卵母细胞和从屠宰场得到的卵巢上采集卵母细胞进行体外培养、受精和发育后的囊胚发育率为30.6±4.3％ 和18.5±1.8％，两种来源的胚胎进行玻璃化冷冻后解冻成活率分别为52.8±4.2％ 和40.2±4.4％，这说明应用OPU技术来提高水牛的繁殖率潜力是巨大的。随后，深入的研究发现，可以采集腔前卵泡进行体外培养来获取卵母细胞。2007年Guptaa证明将采集的腔前卵泡在MEM液和卵丘细胞共培养体系中或MEM液和卵巢间质细胞共培养体系中进行体外培养，进而体外受精，可以得到可移植的水牛体外生产胚胎，这样就可以将卵母细胞的来源扩大到2月龄之后的任何年龄段的母水牛。Santos等近期的实验更证明在胎儿的卵巢上也可以采集腔前卵泡，而且在FSH存在下这些卵泡可以在体外培养存活。Manjunatha 等从不同阶段卵泡的发育潜力来探讨，通过实验证实体外卵母细胞的发育潜力与卵巢的功能形态密切相关，在存在黄体或红体而没有优势卵泡的卵巢上的卵母细胞有最大的发育潜力，有黄体或红体又有优势卵泡的卵巢上的卵母细胞，只有优势卵泡中的卵母细胞具有最大的发育潜力。
      2.2 体外成熟
　　卵母细胞体外成熟已经达到了相当高的程度（70％～90％）。培养液成分虽然复杂但主要成分趋于一致，多为基础培养液（主要有TCM—l99、Ham’S F—l0MEM）加激素（FSH、LH和E2）和生长因子（EGF和IGF），再加缓冲物（Hepes和NaHCO3）。但是，有实验表明在以上培养液中添加10％的卵泡液，水牛卵母细胞的第一极体排放率和成熟率均有进一步显著提高，在颗粒细胞单层共培养对水牛卵母细胞的体外成熟影响上，还有不同的意见。但是，毫无疑问的是卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量。
　　体外成熟时间也会影响到卵母细胞后续的发育潜力，目前认为体外成熟时间应该不少于16h。而且，水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率(19.0％ or 17.7％)明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率(12.3％ Or 13.8％)。Sharma等对卵母细胞体外成熟时间长短对玻璃化后解冻卵母细胞成活率影响的实验，证明体外成熟时间的长短明显影响玻璃化解冻后的成活率和解冻后卵母细胞达到M-II期的比例，从0、6、12、18和24h对比来看，成活率与体外成熟时间的长短成正比。
      2.3 体外受精
　　水牛卵母细胞进行体外受精时常采用TALP液或BO液作受精液，在获得高活力精子时常常采用Percoll梯度离心后在获能液中上浮的办法来筛选。目前IVF后的卵裂率为40％～50％。但是Mishra等的试验显示，同样培养条件下，IVF的卵裂率仅能达到36.4％，孤雌激活后的卵裂率可以达到52.5％，试验证明水牛卵母细胞在遗传上有很好的发展潜力，目前的IVF卵裂率可能受到多方面因素的影响，还有继续提高的余地。共培养时间的长短是影响体外受精率的因素中之一，卵母细胞与精子共培养的时间不少于8h，才能保证精子穿透卵子，但是过长的共培养时间又会导致受精卵暴露于受精过程中产生的氧气中，这对受精卵是有害的，而且，延长受精时间会导致多精入卵的增加；Totey等发现2Oh的共孵化时间对水牛体外受精是最合适的。精液浓度对体外受精率的影响上，试验证明2xl06／ml的浓度是最佳的。获能诱导剂的存在与否也是影响体外受精率的因素，这些物质有肝素、咖啡因、青霉胺和亚牛黄酸等，它们可诱导精子的超运动，降低精子穿过透明带的时间，诱导精子获能和精子头部粒蛋白，可提高受精率、卵裂率和囊胚率。
      2.4 胚胎体外培养
　　在胚胎的体外培养中，囊胚率低始终是体外胚胎生产的一个制约因素。在提高囊胚率的努力中，研究发现输卵管上皮细胞与受精卵共培养可以促进早期胚胎的体外发育，克服发育中的阻断现象，增加可以发育到囊胚期胚胎的数量；克服发育阻断现象的另一个方法是每隔48h的半量换液。引起牛胚胎发育阻滞的另一个重要原因是体外条件下产生多种氧化产物和过氧化物分子对胚胎的伤害，Gasparrini等加胱氨酸于半胱胺（巯(基)乙胺）富集的培养体系能够显著增加卵裂率和可移植胚胎的数量。然而，这些措施都没能使体外胚胎培养的囊胚率超过35％。
　　总体看来，目前体外生产胚胎由于其高代价和低效率（产犊率只有10.5％）、体外生产胚胎经玻璃化冷冻后的存活率又非常低等原因都限制了IVF技术的大规模商业应用，还只能处在小范围的实验阶段。
      3. 性别控制
　　性别控制技术在家畜繁殖中的作用显而易见，在那些经济效益与性别相联系的家畜中，应用这一技术使得其不必等到动物出生后再来剔除不希望的性别，避免了经济和时间的损失。一些试验进行了这方面的探索，Appa Rao等1999年试验了复合套式聚合酶链式反应（RT-PCR）在检验体外生产水牛胚胎性别上的有效性，结果证明应用1～2个卵裂球细胞可以准确、可靠地检验体外生产胚胎的性别。2007年广西大学的研究者证明用黄牛的SRY基因设计的引物进行PCR同样可以准确地判别水牛胚胎的性别。而流式细胞仪的应用使繁殖的效率更高，Lu YQ等用流式细胞仪分离水牛X和Y精子的成功率分别是94％和89％，并用分离后的精子进行体外受精，发现与未进行分离处理的精子相比，分离精子进行受精的胚胎发育率明显下降，但6～8天的桑椹胚发育率无显著差异，X精子受精胚胎经移植后产出2头母犊。2005年Presicce等用经过分离后的精子进行人工授精后成功得到的后代，与自然受精产生的后代在出生重和生活力上没有差别。
      4. 克隆技术
　　通过细胞核移植是一个潜在的提高水牛繁殖率的方法。2005年Meena CR通过将水牛胎儿皮肤成纤维细胞核移植到去核卵母细胞中，经电融合和激活后有3.8％的可以发展到8细胞阶段。2007年Shi D等将水牛胎儿成纤维细胞和粒层细胞的细胞核移植产生的囊胚42枚移植到受体水牛中，产下5头犊牛。证明通过细胞核移植的克隆方法在水牛的繁殖上是可行的。体细胞克隆是提高水牛数量的一个有潜力的途径，但是，与其它物种实验类似的是这种克隆胚胎的发育潜力也会受到损害。经过基因重组和核移植的水牛胚胎从8细胞到囊胚的基因表达水平明显的高于体外受精胚胎。这说明基因重组和核移植的水牛胚胎中的DNA存在低水平的被动甲基化和高水平的重新甲基化。
    毫无疑问，在过去的十多年间我们在水牛繁殖新技术的研究上取得了许多进步也积累了大量有关水牛遗传和生理结构独特性的知识。然而，正像本文所述，还有一些技术的难点未能突破，如何结合实际在这些问题上尽快取得进展，加快水牛的繁殖效率，是我们面对的紧迫任务。

（参考文献：共20篇略）