PCR定性筛选检测方法

　　1996年德国伯恩斯坦大学的MeyerRolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性，植物细胞转入的基因成分一般包括启动子(promotor)、报告基因(reportergene)、目的基因(targetgene)和终止子(terminator)，其中启动子和终止子为表达目的基因所必需。目前，转基因植物所采用的启动子主要为来源于花椰菜花叶病毒的Camv35s启动子、根瘤农杆菌的nos启动子及玄参花叶病毒的FMV35s启动子；广泛应用的终止子分别来源于根瘤农杆菌的nos终止子、花椰菜花叶病毒的camv终止子以及新霉素磷酸转移酶NptII终止子。针对这些基因的PCR扩增可涵盖95％的现有的转基因植物的需要。

　　PCR定性检测是高灵敏度的DNA水平检测，但常伴有各种假性结果出现：(1)DNA提取时产生的各种反应抑制因子，使PCR呈假阴性；(2)产品深加工时核酸被破坏成碎片，含量极低，使PCR呈假阴性；(3)当作物受到花椰菜花叶病毒的感染而带有35S启动子或因农杆菌感染而带有nos终止子时，PCR呈假阳性；(4)实验室的残留污染使检测结果呈假阳性；(5)在收获、运输或加工过程中转基因食品与非转基因食品产生交叉污染也会使检测结果不准确。

　　要防止检测出现假阴性结果，必须在检测过程中严格遵守操作规程，优化PCR条件，在DNA提取过程中尽量去除可能抑制PCR反应的物质，并可通过扩增真核生物的18SrRNA基因来消除假阴性；要消除转基因食品检测中假阳性结果的影响，可采用southern杂交、PCR产物纯化测序或PCR扩增产物酶切分析等方法，对样品同时检测其Camv35s和nos基因双元件，可避免某些作物因自然感染花椰菜花叶病毒或根癌农杆菌产生的假阳性结果。

　　实时荧光定量PCR法

　　实时荧光PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，是指在常规PCR基础上添加了一条标记了两个荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。目前我们应用于实时定量PCR检测体系中的荧光探针主要有3种：分子信标探针，TaqMan探针和杂交双探针。

　　实时定量PCR检测的灵敏度至少是竞争PCR的10倍，它可以检测到每克样品中含2pg转基因的DNA量。对加工、未加工和混合样品都可以进行检测。

　　实时荧光PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，可对整个PCR进程的实时监测。此外，实时荧光PCR采用闭管分析，无需电泳等PCR后处理步骤，能有效消除核酸的交叉污染。由于在PCR反应体系中加入荧光探针，使得非特异性产物不能与探针杂交，尤其对与特异性产物分子量接近、通过电泳无法分开的产物更为有效。当前此方法的挑战就是定量标准物的滞后发展，商业化的标准物已不能满足日渐增长的转基因检测需要。Moreano等以转基因油菜籽为检测目标发展出了一种新型标准物的合成方法，从而为提高荧光定量检测的标准化程度指明了方向。

　　基因芯片检测法

　　当今应用于转基因食品检测的前沿技术当属基因芯片技术，其实质就是高度集成化的反向斑点杂交技术。探针分子固定在载体上，待测基因经过PCR、末端标记等操作，成为标记有荧光染料或同位素的核酸分子，然后与固定的探针杂交。依据标记方法的不同，通过放射自显影、激光共聚焦显微镜或CCD相机读出每个斑点信号的强度，计算机对杂交信号进行处理，得到杂交谱。该技术是20世纪90年代由美国的Affymetrix公司首先发展起来的，该公司曾在1996年制造出世界上第一块商品化基因芯片。

　　免疫学和PCR检测技术大部分情况下一次实验只能检测1种目标分子，在少数情况下能同时检测2～3种目标分子。基因芯片能解决大数量基因检测问题，具有灵敏度高、效率高、成本低、自动化、结果明确等优点。但由于其应用需要的相应设备造价高，普及范围窄，而且目前没有形成任何标准，使得基因芯片检测法应用范围不广。

　　多重连接依赖的探针扩增(MLPA)

　　此方法是转基因多重定量检测的最新进展，最初是由荷兰的Dr．SchoutenJP于2002年发表的应用于医学检测目的高度灵敏的相对定量技术。它是利用简单的杂交、连接、PCR扩增反应，于单一反应管内同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。

　　MLPA方法是针对不同检测序列设计多组专一的探针组，对探针组进行扩增的检测方法。每组探针组总长度不同，可与目标序列杂交黏合。所有探针的5′端都有通用引物结合区PBS(primerbindingsites)，3′端都有与待扩增目标序列结合区，在PBS区与目标序列结合区之间插入不同长度的寡核苷酸，由此形成长度不一的探针组。如果目标序列缺失、产生突变或是由于不同探针组的配对，则这组探针无法成功连接，也没有相应的扩增反应。如果这组探针可与目标序列完全黏合，则连接酶会将这组探针连接成为一个片段，并通过标记的通用引物对此连接在一起的探针组进行扩增。最终经过毛细管电泳和激光诱导的荧光来检测扩增产物。

　　FranciscoMoreano等应用此方法检测了标准的转基因大豆和玉米并经过特异性和敏感性实验验证了MLPA在转基因检测中的可行性。实验表明，当探针与目标序列结合的片段长度越长，检测的敏感性就增加，并且根据转基因序列扩增强度与内参基因扩增强度的比值和转基因含量之间的线性关系，可以对待检样品进行定量分析。