富含共轭亚油酸核桃发酵乳的研制
柴云美，马青雯，和怡，许丽珍，黄艾祥*
云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201
摘要：共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是亚油酸的一种异构体，具有减肥、抗癌、抗动脉粥样硬化等生理功能。本研究以课题组前期筛选的高产CLA的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，L1）为基础，以核桃油为底物，研发一款富含CLA的发酵乳。通过十字交叉划线法发现Lactobacillus fermentum L1与保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus,Lb）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus,St）均不存在拮抗关系。将添加了不同量核桃仁和核桃油的牛奶按照L1：Lb：St=2:1:1比例发酵，发现核桃油发酵乳的CLA含量（151.62～215.94μg/mL）均高于核桃仁发酵乳的CLA含量（76.08～147.99μg/mL）。为进一步提高核桃油发酵乳中CLA含量，通过响应面优化实验得到最佳工艺条件（接种量为6%，核桃油添加量为9%，培养温度为40℃，培养时间为28h）。最佳工艺条件下制备的发酵乳感官评分达90.35，活菌数达lg 8.0 CFU/mL，CLA含量可达225.56μg/mL，其余各项指标良好。本研究为核桃发酵乳及富含CLA的发酵食品的研制提供了理论依据。
关键词：共轭亚油酸；核桃；发酵乳
Development of walnut fermented milk rich in conjugated linoleic acid
CHAI Yunmei，MA Qingwen，HE Yi，XU Lizhen，HUANG Aixiang*
College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming,Yunnan 650201
Abstract：Conjugated linoleic acid (CLA) is an isomer of linoleic acid, which has physiological functions such as weight loss, anti-cancer, and anti-atherosclerosis. This research is based on the Lactobacillus fermentum (L1), which is high-yielding CLA, selected by the research group in the early stage, and uses walnut oil as a substrate to develop a CLA-rich fermented milk. There is no antagonistic relationship between Lactobacillus fermentum (L1) and Lactobacillus bulgaricus (Lb) and Streptococcus thermophilus (St) by the cross-hatch method. Different amounts of walnut kernels and walnut oil were added to the milk, and fermented according to the ratio of L1:Lb:St=2:1:1. The results of the study found that the CLA content of walnut oil fermented milk (151.62～215.94μg/mL) was higher than that of walnut kernel (76.08～147.99μg/mL).In order to further improve the content of CLA in walnut oil fermented milk, optimal process conditions (the inoculation amount was 6%, the addition amount of walnut oil was 9%, the culture temperature was 40℃and the culture time was 28 h )was obtained by the response surface optimization experiment. The sensory score of fermented milk prepared under the optimal process conditions reached 90.35, the number of viable bacteria reached lg 8.0 CFU/mL, the content of CLA reached 225.56 μg/mL, and the other indicators were good.This research provides a theoretical basis for the development of walnut fermented milk and fermented foods rich in CLA.
Key words: conjugated linoleic acid (CLA); Walnut; Fermented milk
1 前言
发酵乳因富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物元素、易于消化吸收等特点而深受消费者的喜爱[1]。随着生活水平的不断提高，人们对食物的需求由最初的“吃得饱”转变为“吃得好”，因此功能性食品应运而生。共轭亚油酸（Conjugated linoleic acids, CLA）作为食物中的天然成分，在奶及奶制品[2]、肉制品[3]等食品中被发现。CLA由于具有抗癌[4]、预防动脉粥样硬化[5]、和减肥[6]等生理功能[7]，近年来被作为保健品投放市场，在农业和食品工业中应用前景广阔，引起人们的广泛关注[8]。人体自身无法合成CLA，只有通过摄取食物来进行补充[9]。目前人们主要从乳制品和肉制品中获取CLA，但乳制品和肉制品中CLA的含量较低，无法满足人们营养健康需求。据报道乳酸菌可以大量转化生成CLA[10],而核桃富含营养物质且亚油酸占不饱和脂肪酸的58%[11]，以核桃为底物可为未来大量获取CLA的一个重要的途径[12]。核桃是云南省的重要种植作物，核桃资源丰富、历史悠久、栽种地域范围广阔。将核桃制作成不同的产品，如核桃乳、核桃油、核桃粉等，可减小农产品滞销带来的风险，保障农民劳动成果，增加农民的收益[13]。
本研究以Lactobacillus fermentum L1、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus为发酵剂，核桃仁、核桃油为底物，研制了一款富含CLA的核桃发酵乳。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1菌种
嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus，St），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus, Lb），发酵乳杆菌Lactobacillus fermentansL1。
2.1.2 原料与试剂
Man Rogosa Share（MRS）培养基、MC培养基均购自Sigma 公司；孟加拉红培养基，广东环凯微生物科技有限公司；核桃油，云南金江绿色产业有限公司；干核桃，昆明宗澳商贸有限公司。
2.2 仪器设备
SW-CJ-IF单人双面超净无菌操作台, 苏州江东精密仪司; STB-505榨油机, 上海精密科学仪器有限公司; TGL2M台式高速冷冻离心机, 长沙迈佳森仪器设备有限公司; UV-1800CP紫外分光光度计, 上海美谱达仪器有限公司。
2.3实验方法
2.3.1 菌种活化
将保藏于-80℃ 冰箱的L1，St和Lb在MRS琼脂培养基上划线培养(37℃, 24h)，从平板上挑取单一菌落至MRS 肉汤培养基中，于37℃培养24h，活化至第三代备用。
2.3.2 菌种共生关系研究
在平板上采用十字交叉划线研究L1， St和Lb间是否存在拮抗关系。
2.3.3菌种驯化
将活化至第三代的L1，以逐步减少接种量（10%、8%、6%、4%）的方法进行逐级驯化。将传至第三代的St和Lb，分别与牛奶以1:1的比例混合均匀，于40℃培养至凝乳后即完成驯化。
2.3.3两种类型核桃发酵乳的制作
2.3.3.1原料乳制备
（1）核桃仁原料乳制备：采用食品级NaOH在80℃处理5min后进行去皮，用小型粉碎机粉碎并过100目筛筛分。将核桃颗粒和脱脂乳以3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的比例混合后进行巴氏灭菌（60～80℃，30min）。
（2）核桃油原料乳制备：将单甘脂、蔗糖脂按照0.3%（g/g）的比例与核桃油混合，用打蛋器搅打制备乳化液。将核桃油乳化液加入脱脂乳中，配制成核桃油含量为3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的原料乳。原料乳经胶体磨处理三次，每次2min，高压均质机均质三次，压力为18 MP，均质结束后进行巴氏灭菌（60～80℃，30min）。
2.3.3.2发酵乳制备
将L1: St: Lb=2:1:1比例以2%（v/v）的接种量分别接入灭菌好的核桃仁、核桃油原料乳中，并于37℃下培养24h后放入4℃冰箱中后熟12h。
2.3.3.3发酵乳CLA含量的测定
参照朱振元等的方法[16]，略作调整，在分液漏斗中加入10mL发酵乳、30mL水、30 mL正己烷中振荡萃取，静置20 min后再加入30 mL正己烷进行第二次萃取，其他步骤同上进行3次萃取，加入150 ml的水静置2 h，弃去下层液体，收集上层正己烷层即为萃取液，加入少量无水硫酸钠吸水干燥萃取液用0.22 μm滤膜过滤后移至10 mL的容量瓶，之后用紫外分光光度计进行检测。以未接种的发酵乳为参比，在232 nm（CLA 最大吸收波长）下测定萃取液吸光度。并根据公式y=0.0781x-0.0508（R2=0.9993）计算CLA含量。
2.3.4单因素试验
以CLA的产量为指标，通过单因素试验分别考察接种量（3%、4%、5%、6%、7%）、核桃油添加量（3%、6%、8%、10%）、培养温度（30 ℃ 、35 ℃ 、38 ℃、40℃、42℃）及培养时间（20 h、24 h、26 h、28 h、30 h）对CLA产量的影响。
2.3.5 响应面试验设计
综合产CLA含量的各单因素试验结果，选取接种量、培养温度、培养时间和底物添加量为响应面分析试验因素，分别以A、B、C、D表示，试验因素和水平设计见表1，使用Design-Expert软件进行Box-Behnken设计。
2.4成品理化指标检测
参照GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验-菌落总数测定》[14]测定活菌数，参照GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度测定》[15]测定滴定酸度。
2.5发酵乳的感官评价
感官鉴定发酵乳，如下表2内容，观察发酵乳的色泽、质地、滋味，同时留意异味、杂质、沉淀等情况。
3 结果与分析
3.1共培养对菌种活性的影响
由图1可知， L1分别与St（左）和Lb（右）交叉划线后，交叉划线区域未出现抑菌现象，说明菌种间不存在抑制。研究结果与张璐[18]、蒋欣容[19]的实验结果一致，说明菌株可以共同生产发酵乳。
3.2菌种驯化后凝乳活力
菌种经过驯化后的凝乳情况见表3所示。St和Lb菌种经过在牛奶中驯化后凝乳时间由6h缩短至了4h，菌落总数均在lg 7.0 CFU/mL以上，滴定酸度均在70 oT以上，凝乳后有少量的乳清析出；L1经驯化后凝乳时间得到明显的改善，由未驯化时的28h凝乳缩短至了6h，菌落总数均在lg 6.5 CFU/ mL以上，滴定酸度接近70 oT，发酵凝乳后无乳清析出。菌株经驯化后缩短了凝乳时间的结果与李转羽等[20]的研究相似，说明菌株经过驯化后适应了在牛奶中的生长环境，从而明显的提高了菌株活力缩短了凝乳时间。
3.3 两种类型核桃发酵乳的CLA含量比较
两种类型核桃发酵乳CLA含量如图2所示。随着底物添加量的增加（3%~10%），核桃油发酵乳与核桃仁发酵乳的CLA含量呈现先增加后减少的趋势，核桃油发酵乳的CLA含量（151.62～215.94 μg/mL）高于核桃仁的CLA含量（76.08～147.99 μg/mL），当添加量为8%时CLA含量最高。出现这个结果的原因可能是亚油酸是乳酸菌产生CLA的底物，据报道核桃仁中生成CLA的前体物质亚油酸的含量（60.3%）[21]低于核桃油中的亚油酸的含量（80. 21%）[22]。故在后续实验中，以核桃油为底物进行研究。
3.4发酵条件优化
3.4.1接种量对共轭亚油酸含量的影响
菌株不同接种量对发酵乳产生CLA含量的影响如图3所示。随着接种量的增加（3%~7%），CLA含量呈先增加后减少的趋势，接种量为6%时CLA含量最高（199.64 μg/mL）；接种量高于6%时，发酵乳的CLA含量开始下降。本试验与于田等[23]人的试验结果相一致，原因主要是接种量的多少会影响菌体的生长速度，刚开始随着接种量的增加，菌体生长旺盛，新陈代谢快，CLA合成量增大。
3.4.2 底物添加量对共轭亚油酸含量的影响
由图4可知，底物添加量在3%～8%范围内时，CLA含量随着底物添加量的增加而增加。底物添加量为8%时CLA含量达到最高（216.15 μg/mL），而高于8%时CLA含量。本研究结果与金磊等[24]的结果一致，原因主要是异构酶异构化亚油酸含量，与底物亚油酸添加量有关，底物添加量少，所以CLA合成就少，随着底物添加量增加，CLA的合成量也逐渐增大；当浓度高于一定值时，菌株将无法利用底物，CLA合成减少[25]。
3.4.3培养温度对共轭亚油酸含量的影响
培养温度对发酵乳CLA含量的影响如图5所示。当发酵温度为30℃～42℃时， CLA的合成量呈先增加后减少的趋势。温度为40℃时CLA产量达到最高（213.23 μg/mL），当温度高于40℃时，CLA含量开始下降。本研究结果与张丽莉[26]的研究结果一致，菌株发酵时温度过低，将会导致菌株出现休眠状态；发酵温度过高，导致乳酸菌未进行发酵就死亡。
3.4.4 培养时间对共轭亚油酸含量的影响
培养时间对发酵乳中的CLA含量的影响如图6所示。由图6可知，发酵乳在培养20 h～28 h时CLA的含量持续增高 (85.56 μg/mL～212.06 μg/mL)，培养时间超过28h后CLA开始降低。产生此结果的原因主要是随着培养时间的延长，由于共轭双键的不稳定性，不饱和脂肪酸最终被还原成饱和或单不饱和脂肪酸[27]。
3.5响应面试验优化发酵条件
3.5.1响应面试验设计及结果
根据单因素实验结果，建立Box-Behnken Design中心组合设计，Box-Behnken Design中心组合设计的原理是以CLA含量为响应值，接种量（A）、培养温度（B）、培养时间（C）及底物添加量（D）为因素，通过建立数学模型，来获得最佳发酵条件。表4为响应面实验设计方案及结果。
3.5.2建立模型及显著性检验
利用Design-Expert8.0.6软件对表6进行多元回归拟合，得到的二次方程模型为：Y=+220.89+2.20* A-3.64* B+1.65* C+7.84* D-19.37* A2-13.37* B2-18.32* C2-14.60* D2+2.20* A * B+4.70* A * C-1.47* A * D-1.17* B * C+1.27* B * D+7.87* C * D。回归模型的方差分析结果见表5。
由5可知，所建立模型的P＜0.000 1，显著；失拟项P＞0.05，不显著，表明模型具有较高可靠性；调整决定系数R2=0.9757，信噪比Adeqprecisior=19.948也从另一个方面表明此模型是可靠的。经方差分析，3个因素对富含共轭亚油酸核桃发酵乳影响的主次顺序为D＞B＞A＞C，即底物添加量＞发酵温度＞接种量＞发酵时间。
3.5.3响应面分析
当响应面呈现为马鞍形时表示交互作用显著[28]。如图7所示，说明接种量与培养时间、培养时间与底物添加量之间的交互作用明显，且对响应值的影响较为显著，与方差分析结果有着较好的一致性。
3.5.4最佳发酵条件的确定和回归模型的验证
对回归方程进行逐步回归，确定最佳工艺参数：6.05%菌种接种量，39.66℃的发酵温度，28.25h的发酵时间，8.95%的底物添加量，CLA含量评分预测值为222.42μg/mL。为了切合实际操作情况，确定发酵乳最佳发酵工艺为：6.00%菌种接种量，40.00℃的发酵温度，28.00h的发酵时间，9.00 %的底物添加量。在上述最佳条件下进行验证，得到发酵乳CLA的最佳含量为225.56 μg/mL，与理论值接近。
3.6富含CLA发酵乳的品质特性
3.6.1理化和微生物指标测定
由表6可知，非脂乳固体（8.73 μg/mL±0.54）、蛋白质（3.94±0.20）、酸度（71.81±1.28）的检出量均符合国标的规定；大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母和霉菌均未检出，乳酸菌的活菌数也符合国标要求，表明产品符合质量标准。
3.6.2 富含CLA发酵乳的感官评价
如图8所示，富含共轭亚油酸的酸奶的评分良好，平均分为90.35；组织状态、滋味、风味、色泽的平均分分别为27.4、26.95、17.75、18.25。风味的感官评分较低，原因可能是发酵核桃乳中有机酸、脂肪酸等营养成分含量的增减在一定程度上会改变物质的香气成分，与李佳[29]的研究相似，发酵后的发酵乳会要呈现一定的生味和油脂。
4 结论
实验室筛选的Lactobacillus fermentumL1可与Streptococcusthermophilus和Lactobacillus bulgaricus复配制作发酵乳。响应面优化实验得到最佳工艺，研制出一款色香味俱佳，活菌数达为lg 8.0 CFU/mL，CLA含量达225.56μg/mL的富含CLA的发酵乳。该发酵乳的研制丰富了核桃发酵乳的种类，并为富含CLA的发酵食品的研发提供了理论依据。
参考文献
[1] 蒙新文, 韩永霞. 酸奶中益生菌的保健功效及研究进展[J]. 现代食品, 2021(03): 44-45+58.
[2] Cicognini FM, Rossi F, Sigolo S, et al. Contents of conjugated linoleicacid isomers cis9, trans11 and trans10, cis12 in ruminant andnon-ruminant meats available in the Italian market [J]. Ital J Anim Sci,2016, 13(2): 124–124
[3] Pimentel LL, Fontes AL, Salsinha AS, et al. Microbiological in vivoproduction of clna as a tool in the regulation of host microbiota in obesitycontrol [J]. Hist Stud Nat Chem, 2018, 369–394.
[4] Mccarty MF. Activation of ppargamma may mediate a portion of theanticancer activity of conjugated linoleic acid [J]. Med Hypotheses, 2000,55(3): 187–188.
[5] Robyn B, Stephen F, Orina B. Atheroprotective effects of conjugatedlinoleic acid [J]. Brit J Clin Pharmaco, 2016, 83(1): 46–53.
[6] Park Y, Albright KJ, Liu W, et al. Effect of conjugated linoleic acid onbody composition in mice [J]. Lipids, 1997, 32(8): 853–858.
[7] 郭小婧,张东辉.共轭亚油酸酯类衍生物的研究进展[J].中国油脂,2020,45(09):54-61
[8] 刘丽娜,缪锦来,郑洲.共轭亚油酸的生理功能综述[J].食品安全质量检测学报,2020,11(08):2552-2557.
[9] 万永虎,贾东晨,谢志丹,杨娜,乔昕,李小冬,吴嘉,乔敏.共轭亚油酸的合成[J].中国酿造,2013,32(04):5-11.
[10] 马青雯,黄艾祥.乳酸菌产共轭亚油酸研究现状[J].食品安全质量检测学报,2020,11(14):4556-4561
[11] 郝艳宾,王克建,王淑兰,庄艳玲.几种早实核桃坚果中蛋白质、脂肪酸组成成分分析[J].食品科学,2002(10):123-125.
[12] 高鹤. 双歧杆菌生物转化共轭亚油酸的机制研究[D].江南大学,2020.
[13] 李娅, 韩长志. 云南省核桃产业发展现状及对策分析[J]. 经济林研究, 2012(04):162-167.
[14] GB 4789. 2-2016, 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].
[15] GB 5009. 239-2016, 食品安全国家标准食品酸度的测定[S].
[16] 朱振元, 唐亚丽, 杨雪莹, 等. 产共轭亚油酸菌株的筛选及条件优化[J]. 中国食品学报, 2017, 17(02): 63-68.
[17] GB 4789. 15-2016, 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数[S]
[18] 张璐,梁锦,黄天姿,等.单一及混合益生菌发酵猕猴桃果汁的香气成分分析[J/OL].食品科学:1-14[2021-04-21].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20210306.0922.002.html.
[19] 蒋欣容,瞿恒贤,陈大卫,等.乳酸菌混合发酵对抑菌作用的影响研究[J].中国乳品工业,2017,45(09):11-16.
[20] 李转羽,刘松玲,金君华,等.高效酸奶发酵菌株的驯化及筛选[A].中国食品科学技术学会.乳酸菌与营养健康:第九届乳酸菌与健康国际研讨会摘要汇编[C].中国食品科学技术学会:中国食品科学技术学会,2014:2.
[21] A Pereira, I Oliveira, A Sousa, et al.Bioactive properties and chemical composition of six walnut ( Juglans regia L.) cultivars ［J］. Food Chem,Toxicol,2008( 46):2103－2111.
[22] 戚登斐,张润光,韩海涛,等.核桃油中亚油酸分离纯化技术研究及其降血脂功能评价[J].中国油脂,2019,44(02):104-108.
[23] 于田.乳酸菌混合发酵生产富含共轭亚油酸功能性酸奶的研究[D].大连工业大学,2012.
[24] 金磊,刘萍,李海星,等.富含共轭亚油酸酸奶的特性分析[J].食品与发酵工业,2015,41(06):76-80.
[25] LIU P,SHENS,ＲUAN H,et al. Production of conjugated linoleic acids by Lactobacillus plantarum strains isolated from naturally fermented Chinese pickles［J］.J Zhejiang Univ Sci B,2011,12( 11), 923－930.
[26] 张丽莉. 富含CLA功能性酸奶的开发[D].大连工业大学,2009.
[27] 张亚刚,吾满江•艾力,文彬.共轭亚油酸几何异构体的形成机制[J].新疆大学学报(自然科学版),2003(04):386-389.
[28] 廖紫玉,罗永香,魏光强,王晓婷,黄艾祥.即食玫瑰再制乳饼的研制[J].中国奶牛,2021(08):44-49.
[29] 李佳.发酵核桃乳乳酸菌的筛选、鉴定及性能研究[D] . 河北科技大学,2016.