| 牦牛“奶渣”中乳酸菌的分离鉴定 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
牦牛“奶渣”中乳酸菌的分离鉴定吕俊梅 李进波 朱翠 黄艾祥
（云南农业大学食品科技学院，昆明 650201）
摘要：本文对产自香格里拉的鲜“奶渣”和发酵“奶渣”中的乳酸菌进行分离鉴定。结果表明：从鲜“奶渣”中分离到27株乳酸菌,并鉴定出7种(亚种)，其中德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌和乳酸乳球菌4种菌被确定是鲜“奶渣”中的优势种群。从发酵“奶渣”中分离到40株乳酸菌，并鉴定出9个种(亚种)，其中德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌5种菌被确定是发酵“奶渣”中的优势种群。
关键词：“奶渣”、乳酸菌、优势种群、分离鉴定
Isolation and Identification of Lactobacillus from Yak Nai-zha
Junmei-Lv, jinbo-Li, zhu-cui, aixiang-Huang
Faculty of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201
Abstract：In this paper, the lactobacillus were isolated and identified from fresh Yak Nai-zha, which was made by congealing、depositing and pressing the remaining part of Yak milk that has been extracted for fat ,and fermented Yak Nai-zha which was made by smoking、toasting and fermenting the fresh Yak Nai-zha for a period of time. The results indicted that 27 strains lactobacillus were isolated from fresh Yak Nai-zha, and they have been identified as 7 differential species. of this , L.delbrueckii、L.maltaromicus、L. fermentum and L.lactis are the preponderant microorganisms of all isolated lactobaciIlus. Besides, 40 strains lactobacillus were isolated from fermented Yak Nai-zha, and it has been identified as 9 differential species. of this , L.delbrueckii、L.maltaromicus、L. fermentum、L acidophilus and L.lactis are the preponderant microorganisms of all isolated lactobaciIlus.
Key words: Yak Nai-zha、lactobacillus、preponderant microorganisms 、isolation and identification
0引言 酥油是云南少数民族地区三大传统乳制品之一（乳扇、乳饼、酥油），“奶渣”是牦牛奶经提取奶油（俗称酥油）后的蛋白质、乳糖等营养物质凝固沉淀的副产品，是以酪蛋白为主要成分的高营养食品。由于“奶渣”食用起来太酸，所以民间主要将其用作动物的饲料，这样大大降低它的附加值，使得资源不能够得到有效利用。据报道，牦牛“奶渣”具有特别的酸味和香味。这很可能是与牦牛“奶渣”中生长有一些有益的微生物——乳酸菌有关。乳酸菌是一类发酵糖类并产生乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。乳酸菌作为发酵剂广泛用于多种食品加工，特别在乳品生产等方面，除能改善食品风味外，它还能提高食品营养价值，延长食品保存期等。由于云南地域以及气候的复杂特殊性，香格里拉牦牛“奶渣”很可能生长有特殊的乳酸菌，但是很少有对“奶渣”里面的乳酸菌进行分离鉴定的研究，并且据了解，现在国内大多数发酵食品使用的乳酸菌种都源于进口。因此，对香格里拉牦牛“奶渣”中的乳酸菌进行分离鉴定，除了对食品发酵行业的发展具有很重要的意义外，还对开发应用我国菌种资源也提供了很大的科学依据[1,2]。
1材料与方法1.1实验材料1.1.1 原料鲜“奶渣”（采自云南省香格里拉县，牦牛奶经提取奶油（俗称酥油）后的蛋白质、乳糖等营养物质凝固沉淀压榨而成）。
发酵“奶渣”（采自云南省香格里拉县，鲜“奶渣”经一段时间的烟熏、烘烤、自然发酵形成）。
1.1.2实验设备
SW-CJ-1F型无菌操作台 苏州净化设备有限公司
HPX-9272ME型电热恒温培养箱 上海博讯实业有限公司
CP153型电子天平 奥豪斯仪器有限公司
LS-BOL型立式压力蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂
XS-402型光学显微镜 南京江南永新光学有限公司
1.2 实验方法
1.2.1 “奶渣”中乳酸菌的分离纯化
取样 以无菌操作将牦牛“奶渣”均分为8块，分别从8块里取样，一共取25g。（未切分的奶渣重3公斤左右）。
分离纯化 将25g“奶渣”放入含有225ml灭菌生理盐水的锥形瓶中做成1:10的均匀稀释液，并依次做10倍递增稀释液。选择3个适宜的稀释度，分别在MRS和MC培养基上进行分离培养（MRS培养基和MC培养基中加入1%的碳酸钙），培养温度为37℃，培养时间72h±3h，并分别在厌氧和需氧条件下培养。选取有乳酸溶钙圈的菌落进行纯化培养[3,4]。
1.2.2 乳酸菌的鉴定
革兰氏染色 将分离菌株进行革兰氏染色[5]。
生理生化试验 将分离出的乳酸菌进行过氧化氢试验、硝酸还原试验、吲哚试验、乳酸纸层析试验[6]。
糖发酵试验 将分离纯化好的乳酸菌分别接种于阿拉伯糖 、纤维二糖、果糖 、半乳糖 、葡萄糖 、乳糖 、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、棉籽糖、松三糖、蜜二糖、核糖、鼠李糖、水杨素 、山梨醇、蔗糖 、海藻糖 、木糖发酵管中进行发酵[1,2,4]。
2 结果与分析
2.1 从鲜“奶渣”中分离到了27株7种乳酸菌（见表2），菌落周围有明显的透明溶钙圈，有的菌落呈辣椒籽状；从发酵“奶渣”中分离到了40株9种（见表2）乳酸菌，菌落周围也有明显的透明溶钙圈。菌落大多呈圆形，边缘整齐，表面光滑。由于菌落周围有溶钙圈，说明分离出的很可能是乳酸菌，因为当乳酸菌生长代谢出乳酸后，才能使菌落周围碳酸钙溶解，并且还能通过观察溶钙圈的大小，了解其产酸的多少。
2.2 革兰氏染色均为阳性，不运动、不形成芽孢和荚膜。并且观察到分离到的乳酸菌大多呈短杆状或球状，少数杆状的乳酸菌稍带弯曲，杆菌菌体粗细在0．6～1.0µm之间，长短l.0～6.0µm之间，并呈链状，球菌直径大小在0.6～1.0µm之间，也呈链状，符合乳酸菌大小标准范围[6,7,8]。
2.3 鲜“奶渣”和发酵“奶渣”中分离出的乳酸菌经试验证明过氧化氢试验、硝酸还原试验、吲哚试验都呈阴性，说明其符合乳酸菌的一些理化性质。并经葡萄糖发酵液纸层析试验后，结果显示黄斑位置与2％乳酸对照点接近，而培养空白对照则无黄斑出现，说明分离出的菌确实产生了乳酸。
2.4 鲜“奶渣”和发酵“奶渣”中分离出的乳酸菌的糖发酵试验结果见表1，并根据糖发酵试验结果鉴别出所分离的乳酸菌的种类。
表1 分离乳酸菌的糖发酵试验结果
注：符号：+，糖发酵试验为阳性；-，糖发酵试验为阴性；d，糖发酵试验部分为阳性,ND，表示未测定
根据上述试验结果及分析得到表2：
表2 “奶渣”中乳酸菌的种类、数量
从表2可看出，从鲜“奶渣”中分离出27株乳酸菌，并鉴定出7种(亚种)，分别是德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌，其中德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳球菌分别占18.5％，14.8％，18.5％，33.3％，被确认为优势种群；从发酵“奶渣”中分离到40株乳酸菌，并鉴定出9个种(亚种)，分别是德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌和瑞士乳杆菌，其中德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌分别占17.5％，7.5％，15％，20％，27.5％，被确认是优势种群。有研究表明[9,10]，从乳饼和乳扇中也分离出德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌等乳酸杆菌，德氏乳杆菌常用作酸奶、干酪等各种发酵乳制品的发酵剂，麦芽香乳杆菌可用作各种麦芽风味乳制品的生产，发酵乳杆菌可用作干酪的生产，嗜酸乳杆菌可用作酸奶、嗜酸乳杆菌发酵乳等乳制品的发酵剂，还可被制成微生态制剂用作保健品。除此之外，还可看出鲜“奶渣”和发酵“奶渣”中的乳酸乳球菌都分别占最大比例,而乳酸乳球菌可用作各种干酪、发酵稀奶油等的发酵剂。因此，对香格里拉鲜“奶渣”和发酵“奶渣”中的乳酸菌进行分离鉴定为发酵行业中发酵剂的选择提供了更广阔的资源。
3、结论
本研究弄清了香格里拉牦牛“奶渣”中乳酸菌的基本情况，从鲜“奶渣”中分离出27株乳酸菌，经鉴定为7种，分别是德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌，其中的德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳球菌4种菌是优势种群；从发酵“奶渣”中分离到40株乳酸菌，经鉴定为9种，分别是德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌和瑞士乳杆菌，其中德氏乳杆菌、麦芽香乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌5种菌是优势种群。本研究分离并鉴定出香格里拉牦牛奶渣中乳酸菌的种类，并确定了优势种群，可为优良乳酸菌的筛选利用奠定基础，并对中国食品发酵行业的发展提供了一定的科学依据。
参考文献
1 孟祥晨,杜鹏，等.乳酸菌与乳品发酵剂[M].北京：科学出版社，2009.8.
2 杨洁彬,郭兴华，等.乳酸菌——生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版杜,1996.4.
3 张丹凤,罗晓红，等.乳品检验员[M].北京：中国劳动社会保障出版社，2009.
4 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999,3.
5 许国强.实验微生物学[M].开封：河南大学出版社，2006.12.
6 中国科学院微生物所编．一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学技术出版社，1978．11.
7 Buchanan R E，Gibbons N E. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed[M]． Baltimore: Williams and Wilkins Company, 1974.
8 Holt J G. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed[M]．Baltimore:
Williams and Wilkins Company, 1994.
9 张以芳.乳饼制品中乳杆菌分离鉴定及其发酵性能试验[J]. 中国乳品工业，1999(3):22-24.
10 张以芳.乳扇制品中乳杆菌分离鉴定及其发酵性能试验[J]. 中国奶牛, 2000(2)：22-23.
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